造血器腫瘍に対する新規染色体診断法の開発

1.「多発性骨髄腫における新規染色体診断法　ISM-FISH(Immunophenotyped-Suspension-Multiplex-FISH)法の開発　～イメージングフローサイトメトリーを用いた3種の多発性骨髄腫関連IGH転座のマルチプレックスFISH検査法～」

多発性骨髄腫は多数の遺伝子異常、染色体異常の蓄積により発症、進展する造血器悪性腫瘍です。疾患発症の初期イベントとして免疫グロブリン重鎖(immunoglobulin heavy chain gene: IGH)遺伝子関連染色体転座、または高二倍体が関与していると考えられています。IGH関連転座としては、t(11;14) (q13;q32) (CCND1::IGH)が最多の約15-20%の症例で観察される他、t(4;14) (p16;q32) (FGFR3::IGH)、t(14;16) (q32;q23) (IGH::MAF)の異常がありますが、これらの染色体転座は、予後因子としての意義だけでなく、適した治療法を選択するうえでも重要な指標となります。

従来、多発性骨髄腫の染色体転座診断にはfluorescence in situ hybridization (FISH)法（以下FISH法）が日常診断で用いられてきました。しかし一般的なFISH法は一回の検査で単一の染色体異常しか検出することができず、個々の転座を評価するためには数百個の細胞を鏡検者が目視で診断する必要がありました。こうした熟練と技能を要する煩雑な検査を繰り返すことは日常診療で大きな負担となっており、複数の染色体異常を同時に、かつ迅速に検出可能な高精度の診断技術の開発は、長きにわたり残されてきた課題でした。

こうした課題を克服するため、われわれの共同研究グループは大量の細胞の状態を蛍光染色パターンと細胞の形で迅速に識別可能なイメージングフローサイトメトリー法と、複数の染色体異常を同時に異なる蛍光標識プローブで検討するマルチプレックスFISH法を組み合わせ、多発性骨髄腫の診療において重要な複数のIGH遺伝子関連転座を同時解析できる検査法を新規に開発し、ISM-FISH（Immunophenotyped-Suspension-Multiplex-FISH）法と命名しました。

具体的には、多発性骨髄腫由来の細胞株、および同疾患の患者さん由来の骨髄検体を、CD138とよばれる多発性骨髄腫に特徴的な表面抗原に対する蛍光標識抗体と、4種類の遺伝子座(IGH、FGFR3、CCND1、MAF遺伝子)を標識する蛍光標識DNAプローブにて処理し、シスメックス社製イメージングフローサイトメトリー装置(MI-1000)により解析します。この方法により、1細胞毎に5種類の蛍光シグナルの解析や、さらに10分間で約1万個の細胞を解析することが可能となりました。患者由来の検体中には、骨髄腫細胞と非腫瘍細胞が混在していますが、本システムではCD138抗原陽性である腫瘍細胞のみを解析画面上で特定し、新規に開発した解析アルゴリズムを用いてIGH遺伝子シグナルの座標と、転座相手となるFGFR3、CCND1、MAF遺伝子のシグナルとの距離を算出することで既定値を満たした場合に「転座陽性」と判定しました。この結果、多発性骨髄腫由来細胞株を用いて既知の各染色体転座を正確に検出できただけでなく、患者検体でも従来のFISH法と比較して高い精度(陽性適中率96.6%、陰性適中率98.8%)で診断可能です。また、従来のFISH法での検出感度は約1%と考えられていますが、ISM-FISHの検出感度は従来のFISH法の約10倍と考えられます(Tsukamoto T, J Hum Genet 2023）。

2.「染色体微小欠失を同定可能とする増幅FISH(amplified FISH: AM-FISH)法の開発」

造血器悪性腫瘍では、B細胞悪性リンパ腫（BCL）におけるCDKN2A遺伝子、A20遺伝子、急性リンパ性白血病（ALL）で見られるIKZF1、PAX5、骨髄異形成症候群（MDS）で見られるERG1、TET2、ASXL1の微小領域欠損などが予後不良に直結することが知られています。一方、現時点では日常臨床で安価・簡便にスクリーニングするシステムは皆無であり、簡易、安価、迅速なアッセイ系の構築は必要不可欠です。私たちのグループは、単独遺伝子のみをターゲットとした数Kb～数十Kb(20~40Kb程度)程度の微細領域FISHプローブを作成し、さらに蛍光増幅技術を応用することでシグナル感度を向上することで、単独遺伝子レベルでの遺伝子欠失の検出を可能とする増幅FISH法を確立しました。本法により、染色体微小領域欠失に由来する予後関連単独遺伝子の欠失の迅速な高精度分子診断を実現可能です。